变形杆菌怎么检测

由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒，属于严重的公共卫生问题。目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且免疫学方法的特异性和敏感性均较低。

有研究开发了一种变形杆菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为变形杆菌的ureR---GenBank登陆号：Z18752，所述引物与所述靶基因的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

 

利用上述引物组的基于环介导等温扩增法检测变形杆菌的检测方法是通过如下技术方案实现的：以变形杆菌的ureR(Z18752)基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。

 

具体检测方法为：

 

1、样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA；

 

2、变形杆菌的环介导等温扩增(LAMP)取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约60-65℃条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。反应体系为(反应总体积20ul～100ul)；

 

3、LAMP反应产物的检测：A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。